Витамин B12
Витами́нами B12 называют группу биологически активных веществ, называемых кобаламинами и относящиеся к корриноидам, содержащим в структуре атом кобальта (III) и являющиеся хелатными соединениями.
В научной литературе под витамином B12 обычно подразумевают цианокобаламин, который свободно преобразуется в одну из коферментных форм в человеческом организме. В форме цианокобаламина в организм человека поступает основное количество витамина B12, при этом он не является синонимом B12, несколько других соединений также обладают B12-витаминной активностью. Витамин B12 также называется внешним фактором Касла.
В природе продуцентами этого витамина являются бактерии и археи, в растениях не синтезируется.
--------------------
История открытия
Впервые влияние на развитие анемии недостатка какого-то вещества обнаружил исследователь Уильям Мёрфи в эксперименте на собаках, у которых была искусственно вызвана анемия. Подопытные собаки, которым давали в пищу большое количество печени, излечивались от анемии. Впоследствии учёные Джордж Уипл и Джордж Майнот поставили перед собой задачу выделить из печени фактор, непосредственно отвечающий за это лечебное свойство. Это им удалось, новый противоанемийный фактор получил название витамина B12, и все трое учёных в 1934 году были удостоены Нобелевской премии по медицине. Молекулярную химическую структуру цианокобаламина установила Дороти Кроуфут-Ходжкин в 1956 году по данным рентгеноструктурного анализа.
----------------
Химическое строение
Пространственная структура цианокобаламина, отмечены: зелёным кобальт, оранжевым фосфор, синим азот, серым углерод, розовым углерод образующий корриновое кольцо, красным кислород
К кобаламинам относятся:
собственно цианокобаламин (Со-α-[α-(5,6-диметил-бензимидазолил)]-(Со-β-циано)кобамид; CN-Cbl; С63H89O14N14PCo) в котором с кобальтом связывается CN–-группа, наиболее устойчивое соединение, синтезируемое или образующееся при искусственном выделении из живых организмов, в естественных условиях не встречается;
гидроксокобаламин (или оксикобаламин, или витамин B12a: Со-α-[α-(5,6-диметил-бензимидазолил)]-(Со-β-гидроксо)кобамид; OH-Cbl; С62H90O15N13PCo) в котором CN– заменена на OH–-группу, природная активная форма витамина B12 присутствующая в организмах животных, обратимо превращается в кислой среде в аквакобаламин;
аквакобаламин (или витамин B12b: Со-α-[α-(5,6-диметил-бензимидазолил)]-(Со-β-аква)кобамид; aq-Cbl; С62H91O15N13PCo) продуцируется микроорганизмами, обратимо превращается в щелочной среде в гидроксокобаламин;
нитрокоболамин (или витамин B12c) в котором CN– заменена на ONO–-группу;
коферментные формы витамина B12: метилкобаламин и кобамамид;
диаквакобинамид.
В природе обнаружены либо искусственно синтезированы кобаламины и с другими лигандами: сульфатокобаламин (SO3-), хлорокоболамин (Cl-), бромокоболамин (Br-), тиоцианатокобаламин (SHC-), дицианокобаламин [(RCo—CN)CN]-. Возможно образование гексаперхлората цианокобаламина. Витамин B12с образуется из витамина B12b под воздействием азотистой кислоты, также синтезируется Streptomyces griseus[en]. Все производные кобаламина проявляют биологическую активность витамина B12. При взаимодействии с CN-, производные превращаются в цианокобаламин. В кислой среде из цианокобаламина образуется биологический низкоактивный циано-13-эпикобаламин (неовитамин B12) в котором пропионамидная группа в кольце «C» (с метильной группой) коррина пространственно расположена с другой стороны. При одноэлектронном восстановлении молекулы цианокобаламина образуется устойчивый в кристаллическом состоянии витамин B12t c двухвалентным атомом кобальта, при двухэлектронном восстановлении получается витамин B12s устойчивый в водных растворах и под воздействием кислорода воздуха превращающегося в витамин B12a/B12b в зависимости от pH раствора. Для получения меченых радиоизотопных молекул цианокобаламина либо добавляют радиоактивный изотоп 60Co при культивировании микроорганизмов, либо к оксикобаламину добавляют синильную кислоту с изотопом 14С.
B12 имеет самое сложное по сравнению с другими витаминами химическое строение, основой которого является корриновое кольцо. Коррин во многом похож на порфирины (сложные химические структуры, входящие в состав гема, хлорофилла и цитохромов), но отличается от порфиринов тем, что два пятичленных гетероцикла в составе коррина соединены между собой непосредственно, а не метиленовым мостиком. В центре корриновой структуры располагается ион кобальта, образующий четыре координационные связи с атомами азота. Ещё одна координационная связь соединяет кобальт с диметилбензимидазольным нуклеотидом. Последняя, шестая координационная связь кобальта остаётся свободной: именно по этой связи и присоединяется цианогруппа, гидроксильная группа, метильный или 5'-дезоксиаденозильный остаток с образованием четырёх вариантов витамина B12, соответственно. Ковалентная связь углерод-кобальт в структуре цианокобаламина — единственный известный в живой природе пример ковалентной связи переходный металл-углерод.
-------------------
Получение витамина B12
До освоения синтеза витамина B12 он мог добываться экстракцией из печени животных. Сначала печень, а затем её экстракт использовались в лечении пернициозной анемии.
----------------------
Химический синтез
Полный химический синтез цианокобаламина (англ.)рус. впервые был осуществлён в 1972 году в результате многолетней совместной работы двух исследовательских групп (одна из которых, руководимая Робертом Вудвордом, работала в Гарварде, а другая, возглавляемая Альбертом Эшенмозером, в Швейцарском федеральном технологическом институте в Цюрихе). Первые работы над синтезом витамина В12 были начаты ещё в начале 60-х годов 20 века. На разработку общей стратегии синтеза и саму работу ушло более 10 лет. В ходе планирования синтеза, молекула была условно разделена на два основных фрагмента, синтезом которых и занимались группы, руководимые Вудвордом и Эшенмозером. Особая сложность синтеза биологически активного витамина В12 была обусловлена, в частности, наличием в корриновом кольце 9 хиральных (оптически активных) атомов углерода. В общей сложности в работах по синтезу, на протяжении ряда лет, участвовали порядка 100 учёных из примерно 20 стран, а сама разработанная схема синтеза включала 95 стадий. Успешный полный синтез соединения столь сложной структуры явился выдающимся достижением синтетической органической химии и на практике продемонстрировал принципиальную возможность химического синтеза "любого" природного соединения, вне зависимости от сложности строения его молекулы.
--------------------
Микробиологическое производство
Для получения препаратов витамина B12 (в основном цианокобаламина) в промышленных масштабах для нужд медицины и сельского хозяйства используется микробиологическое производство. Для производства применяют микроорганизмы и их штаммы-мутанты, такие как:
для медицинских препаратов — Propionibacterium[en] shermanii (штамм М-82 с выходом продукта до 58 мг/л), Propionibacterium freudenreichii[en], Pseudomonas denitrificans[en] (штамм MB 2436 с выходом продукта до 59 мг/л). Используется глубинное культивирование;
для кормовых концентратов витамина B12 — Methanococcus[en] halophilus (с выходом продукта 16-42 мг/л, в питательные среды также добавляются пивные или кормовые дрожжи в качестве источника некоторых питательных веществ и создания благоприятной культуральной среды для метанобразующих бактерий, а также для обогащения кормов витаминами B2, B6, PP). Используется метод ферментации. При производстве так же образуются сопутствующие балластные продукты как фактор А, фактор B (предшественник витамина — кобинамид), фактор III (5-оксибензилиндазол), псевдовитамин B12 и ряд подобных.
Промышленное производство витамина B12 с помощью пропионовокислых бактерий включает следующие технологические стадии:
в течение года в железобетонных ферментерах происходит непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий;
полученная метановая бражка сгущается;
сгущенная масса сушится на распылительной сушилке.
Из-за того, что витамин B12 неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, в метановую бражку перед выпариванием добавляют хлор до оптимального значения pH 5,0—5,3, что делает среду кислой, также добавляется сульфит натрия до оптимального содержания 0,07—0,1%
------------------------
Метаболизм в организме
Всасывание B12 в организме происходит двумя путями — с использованием внутреннего фактора Кастла может всасываться из кишечника 1—2 мкг в течение нескольких часов, второй путь — путём диффузии, при этом поглощается примерно 1 % не использованного по первому пути B12.
В желудке желудочный сок растворяет связанный с белками пищи B12. Формы в таблетках могут проходить через желудок, но для всасывания свободного B12 (не связанного с белками пищи) желудочный сок не нужен. В желудке вырабатывается внутренний фактор Кастла (в некоторых источниках — «Касла»), необходимый для всасывания B12 в кишечнике. R-протеин (другие названия — гаптокоррин и кобалофилин) — связывающий B12 белок слюны, но действовать он начинает в желудке после того, как желудочный сок высвободит B12 из белкового комплекса, тогда этот протеин связывается с ним для того, чтобы сам B12 также не был разрушен желудочным соком. Затем B12 соединяется с внутренним фактором Кастла — ещё одним связывающим белком, который синтезируется париетальными клетками желудка, его выработка стимулируется гистамином, гастрином, пентагастрином и непосредственно пищей. В двенадцатиперстной кишке протеазы высвобождают B12 из комплекса с R-пептидом, затем B12 связывается с внутренним фактором, и только в таком связанном с внутренним фактором виде он распознается рецепторами поглощающих энтероцитов подвздошной кишки. Внутренний фактор защищает B12 от поедания кишечными бактериями.
Поражение любого звена этой цепи может приводить к нарушению всасывания и дефициту B12. При злокачественной анемии существует недостаток внутреннего фактора из-за аутоиммунного атрофического гастрита, при котором организм вырабатывает антитела против париетальных клеток. У пожилых из-за снижения кислотности желудочного сока, снижения функции обкладочных клеток высок риск развития дефицита B12. При этом до 100 % B12, поступившего с пищей, выводится с калом, тогда как в норме этот процент не более 60 %.
После того, как комплекс B12/внутренний фактор распознан специальными рецепторами энтероцитов подвздошной кишки, он поступает в портальный кровоток. Здесь он соединяется с транскобаламином II, обслуживающим транспорт по плазме. Наследственные дефекты выработки транскобаламина, а также рецепторов к нему могут также быть причиной дефицита B12, таких как мегалобластная анемия — и в некоторых случаях при этом в крови может определяться нормальный уровень B12. Далее из плазмы комплекс транскобаламин II/B12 захватывается рецепторами клеток, поступает внутрь клетки и тут наконец B12 высвобождается, а транскобаламин идёт в лизосомы.
Верхний предел поглощения B12 в нормальных условиях составляет 1,5 мкг при поступлении с пищей 5—50 мкг.
Общее количество B12, содержащегося в теле человека, равно 2—5 мг у взрослых. Около 50 % хранится в печени. Примерно 0,1 % в день от этого количества теряется через выделение в кишечнике, в основном с желчью, и большая часть (но не всё) реабсорбируется.
При поступлении B12 выше связывающей способности избыток выводится с мочой.
Благодаря чрезвычайно эффективной энтерогепатической циркуляции печень может хранить запас B12 на 3—5 лет. Поэтому недостаток этого витамина встречается редко. Скорость изменения уровня B12 зависит от того, сколько B12 поступает из рациона, сколько секретируется (выводится) и сколько поглощается. У детей раннего возраста дефицит B12 может проявиться гораздо быстрее.
Закись азота нарушает метаболизм витамина B12, поэтому при использовании закиси азота для анестезии (например, при стоматологических операциях) и пограничном уровне витамина B12 развивается полинейропатия, вызванная дефицитом B12. Также в зоне риска находятся люди, постоянно работающие с закисью азота, в случае плохого уровня проветривания помещений. Подобный дефицит требует терапии фолатами и B12.
--------------------
Биохимические функции
Ковалентная связь C—Co кофермента B12 участвует в двух типах ферментативных реакций:
Реакции переноса атомов, при которых атом водорода переносится непосредственно с одной группы на другую, при этом замещение происходит по алкильной группе, спиртовому атому кислорода или аминогруппе.
Реакции переноса метильной группы (—CH3) между двумя молекулами.
В организме человека есть только два фермента с коферментом B12:
Метилмалонил-КоА-мутаза, фермент, использующий в качестве кофактора аденозилкобаламин и при помощи реакции, упомянутой выше в п. 1, катализирует перестановку атомов в углеродном скелете. В результате реакции из L-метилмалонил-КоА получается сукцинил-КоА. Эта реакция является важным звеном в цепи реакций биологического окисления белков и жиров.
5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин-метилтрансфераза, фермент из группы метилтрансфераз, использующий в качестве кофактора метилкобаламин и при помощи реакции, упомянутой выше в п. 2, катализирует превращение аминокислоты гомоцистеина в аминокислоту метионин.
-----------------
Применение препарата в медицине
Инъекционный препарат витамина В12 набранный в шприц из ампулы
Недостаток в организме витамина В12 вследствие снижения его поступления в первую очередь из-за пониженной секреции внутреннего фактора Касла, нарушения абсорбции витамина из просвета кишечника при ряде заболеваний, при глистных инвазиях и дисбактериозах, синдроме слепой петли, реже вследствие алиментарной недостаточности из-за неполноценного питания или отсутствия транскобаламина II приводит к развитию B12-дефицитной анемии.
Цианокоболамин для лечебных целей выпускается промышленностью в виде растворов для парентерального введения, для целей профилактики его дефицита включается в состав ряда поливитаминных препаратов.
Оксикобаламин, кроме тех же показаний как и цианокобаламин, так же применяется в качестве антидота при отравлениях цианидами и при передозировке натрия нитропруссида, так как цианистое основание более тропно к кобальту в молекуле оксикоболамина, связывает цианистое основание в безвредную форму — цианокобаламин.
В России витамин В12, как и другие витамины группы В, назначают при любом неврологическом состоянии вне зависимости от его этиологии, что противоречит современным научным данным. В частности, лечение витаминами инсульта, деменции и боли в спине не имеет научных оснований.
-----------------
Фармакокинетика
Связь с белками плазмы — 90 %. Максимальная концентрация после подкожного и внутримышечного введения — через 1 час. Период полувыведения — 500 дней. Из печени выводится с желчью в кишечник и снова всасывается в кровь.
------------
Заболевания, связанные с недостатком витамина
При недостатке витамина В12 развиваются некоторые неврологические состояния и заболевания, например, анемия, подострая комбинированная дегенерация спинного мозга (англ.)рус., полинейропатия.
Витамин B12 всасывается в основном в нижней части подвздошной кишки. На всасывание витамина в сильной степени влияет выработка желудком внутреннего фактора Касла. Мегалобластическая анемия может быть вызвана недостаточным потреблением витамина B12 с пищей, недостаточным производством в организме внутреннего фактора Касла (пернициозная анемия), патологическими процессами в терминальной части подвздошной кишки с нарушением всасывания или конкуренцией за витамин B12 со стороны ленточных червей или бактерий (например, при синдроме слепой петли). При дефиците витамина B12 на фоне анемической клинической картины или без неё могут возникнуть и неврологические расстройства, в том числе демиелинизация и необратимая гибель нервных клеток. Симптомами такой патологии являются онемение или покалывание конечностей и атаксия.
В 2000 и 2002 году американская ассоциация психиатров в своём журнале American Journal of Psychiatry опубликовала результаты исследований, говорящие о влиянии дефицита витамина B12 на появление клинических депрессий у пожилых пациентов.
Обычно дефицит витамина B12 лечат внутримышечными инъекциями препарата цианокобаламина. В последнее время была доказана достаточная эффективность пероральной компенсации дефицита пищевыми добавками в достаточной дозе. Суточный расход витамина B12 организмом человека оценивается примерно в 2—5 мкг. Если же давать витамин в количестве 1000—2000 мкг в день, он будет всасываться и при патологии подвздошной кишки, и при дефиците внутреннего фактора Касла. Разработана специальная диагностическая методика по выявлению недостаточности внутреннего фактора Касла, так называемый тест Шиллинга, но нужный для её выполнения реактив пока остаётся очень дорогим и редким.
----------------
Источники витамина
Витамин B12 не синтезируется в организме человека и поступает в организм вместе с пищей животного происхождения или с добавкой. Растительная пища практически не содержит витамина B12. Всасывается витамин в нижнем отделе тонкой кишки. Несмотря на то, что он вырабатывается бактериями в толстой кишке, следующей за тонкой, толстая кишка не способна его всасывать, а в тонкой бактерии практически отсутствуют. Мало того, витамин B12 бактериями также поглощается, поэтому при заболеваниях, из-за которых в тонкой кишке резко увеличивается количество бактерий, у больных может возникнуть B12-ассоциированная анемия в результате соперничества в поглощении витамина между бактериями, обитающими в тонкой кишке и их носителем. Непоглощённые бактериями остатки витамина B12 выводятся вместе с калом.
Многие травоядные животные также не могут синтезировать, и в их кишечнике не всасывается вырабатываемый обитающими там бактериями витамин B12. Однако жвачные животные, включая крупных рогатый скот, имеют специальный отдел желудка — рубец, заселённый производящими витамин B12 симбиотическими бактериями, что позволяет всасывать его в тонкой кишке. После всасывания в кишечнике витамин попадает в кровь, а затем накапливается в печени и мышцах животного или попадает в молоко дойного скота. Другие травоядные животные, — кролики, мыши, крысы и некоторые виды приматов для получения витамина используют копрофагию. Свиньи и курицы всеядны, поэтому витамин поступает к ним вместе с животной пищей, однако его содержание в сыром мясе этих животных ниже, чем в мясе жвачных животных.
В водоёмах витамин B12 производится бактериями и археями, поглощается фитопланктоном и попадает в зоопланктон. В конечном итоге, по пищевой цепи, витамин переносится в тела хищных рыб и его концентрация в мясе крупных рыб оказывается выше, чем в мясе мелких. Большое количество витамина B12 накапливается в печени и почках тунца и лосося. При этом потери витамина в филе рыбы при различных видах кулинарного приготовления оказываются достаточно небольшими — от 2,3 % до 14, 8 %.
Хорошими источниками витамина B12 для человека являются говяжья, свиная и куриная печень, мясо и молоко жвачных животных, рыба, а также ферментированные молочные продукты, такие как сыр и йогурт. Тем не менее при кулинарном приготовлении мяса (за исключением вакуумной обработки) значительное количество витамина разрушается. Потребление же яиц практически не увеличивает содержание витамина B12 в крови (из яиц усваивается менее 9 % витамина). В целом у здоровых людей из пищи усваивается лишь примерно половина содержащегося в ней витамина, при этом с увеличением потребления витамина B12 при приёме пищи его усвояемость уменьшается.
Большинству растений витамин B12 для нормальной жизнедеятельности не требуется, и они его не синтезируют. Фрукты, овощи и зерновые культуры практически не содержат витамина B12. Лишь небольшое количество, менее 0,1 мкг на 100 г, обнаружили в некоторых растениях: его содержат брокколи, спаржа, Белокопытник японский и пророщенный маш, что может объясняться способностью растений всасывать витамин из некоторых органических удобрений. Так, исследования показали, что удобрение почвы коровьим навозом увеличивает содержание B12 в листьях шпината примерно на 0,14 мкг на 100 г. Некоторое количество витамина присутствует в таких ферментированных продуктах, как темпе и натто, однако в самих соевых бобах, из которых эти продукты изготовлены, его обнаружить не удаётся. Небольшое количество B12 может также накапливаться в растениях в результате взаимодействия с бактериями.
Витамин B12 обнаруживался и в плодовых телах высших грибов, не способных его синтезировать, что тоже может объясняться взаимодействием с бактериями. Обычно в съедобных грибах содержится незначительное количество витамина B12 (менее 0,1 мкг на 100 г у сушёных грибов), однако некоторые грибы являются исключением. Так, в высушенных вороночнике рожковидном и лисичке обыкновенной содержание B12 варьируется от 1,09 до 2,65 мкг на 100 г, а в высушенном шиитаке содержится примерно 5,6 мкг на 100 г. При этом считается, что, несмотря на значительное содержание, в шиитаке витамин также попадает извне, предположительно, в результате взаимодействия с синтезирующими B12 бактериями.
В пищевой промышленности витамином B12 иногда обогащают такие продукты, как сухие завтраки, пищевые дрожжи, соевое молоко и вегетарианские заменители мяса.
Для веганов существуют рекомендации наладить регулярный прием препаратов кобаламина, либо употреблять пищу, обогащённую B12, так как растительная пища или не содержит в себе этот витамин, или содержит в слишком малых количествах, а организм человека синтезировать его не может. Дефицит B12 у веганов ведёт к риску развития заболеваний сердца и осложнений при беременности.
----------------
Нормы потребления
Норма потребления, установленная в США, соответствует 2,4 мкг в день для взрослого человека, а верхний предел пока не установлен. Однако расход организма соответствует 2—5 мкг в день, что может превышать установленную суточную норму потребления. Одно из исследований показало, что потребление 6 мкг в день является достаточным для поддержания нормального уровня B12 в плазме крови.
-------------------------
Злоупотребление витамином B12
В выводах сделанных по результатам статистического анализа под руководством Theodore M. Brasky значится, что ежедневное употребление B12 как отдельного витамина в течение 10 лет в повышенных дозах >55 мкг в день увеличивает риск развития рака лёгких у мужчин на 30—40 %. Следует также обратить внимание, что существенная доля заболевших имела долгий анамнез табакокурения. У женщин данная закономерность не выявлена, хотя по результатам исследования отмечается, что в рационе исследуемых женщин витаминов группы B содержалось больше. Аналогичные же результаты выявлены и при употреблении в повышенных дозах витаминов B6 и B9.
------------------
Псевдовитамины B12
Под термином «псевдовитамин B12» подразумевают похожие на этот витамин вещества, обнаруженные в некоторых живых организмах, например, в цианобактериях (ранее известны как сине-зелёные водоросли) рода Спирулина. Такие витаминоподобные вещества не обладают витаминной активностью для организма человека. Более того, эти вещества могут представлять определённую опасность для вегетарианцев, пытающихся с их помощью восполнить дефицит витамина, так как показано в опытах in vitro, что они блокируют метаболизм клеток молочной железы человека. Также их наличие в крови показывает при анализе нормальную концентрацию витамина B12, хотя эти соединения не имеют витаминной активности, что может привести к ошибочному диагнозу и, в результате — к неправильному лечению пернициозной анемии.
Псевдовитамины B12 синтезируются бактериями в анаэробных условиях в кишечнике некоторых животных, в частности жвачных, в канализационном шламе. Не являются витаминами для животных, но являются факторами роста для некоторых бактерий, как и сами витамины B12. Структурно соответствуют цианокобаламину, но вместо 5,6-диметилбензимидазолнуклеозида содержат другие основания. К ним относятся:
«псевдовитамин B12» (или псевдовитамин B12b, циан-β-кобаламин, циан-γ-кобаламин) — 7α-аденилкобамид цианид;
«B12-фактор» — 7α-(2-метилмеркаптоаденил)кобамид цианид;
«Фактор III» — α-(5-оксибензимидазолил)кобамид цианид;
«Фактор A» (или псевдовитамин B12d, псевдовитамин B12f, псевдовитамин B12m, циан-ω-кобаламин) — 7α-(2-метиладенил)кобамид цианид;
«Фактор С» — 9β-гуанозил-5пирофосфокобинамид дицианид;
«Фактор G» — 7α-гипоксантилкобамид цианид;
«Фактор H» — 7α-(2-метилгипоксантил)кобамид цианид;
α-бензимидазолилкобамид цианид;
α-(5-метилбензимидазолил)кобамид цианид;
7α-гуанозилкобамид цианид.
Псевдовитамины продуцируемые микроорганизмами одновременно с витаминами и обладая схожими физико-химическими свойствами, представляют определённую трудность для очистки витаминов при промышленном производстве, в частности для этих целей может применяться электрофоретическое разделение.
